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代孕技术 卵母细胞的体外成熟

为了保证辅助生殖技术的成功率,通常需要获得多个卵母细胞。但是控制性超排卵的近、远期问题特别是一些严重的并发症已引起人们的广泛重视,一些不能接受超排卵治疗而有生育要求如乳腺癌、卵巢癌术后的患者,也无法进行常规的辅助生殖技术。卵母细胞的体外成熟可为解决这些难题提供手段。
IVM的大致过程是:于卵泡期使用小剂量Gn刺激后,卵泡直径达到5-12mm时,在阴道B超引导下,采用双腔针低负压穿刺卵泡抽吸取卵,并以磷酸缓冲液(BPS)冲洗卵泡1-2遍,将卵泡穿刺液及冲洗液收集,然后在解剖显微镜下寻找卵丘复合体(Oocyte-cumulus complexes, OCCs),在将剩余液体转移到Em-Con Filter中用37℃卵泡冲洗液反复冲洗以去除红细胞和一些小的细胞碎片,待卵泡液冲洗清亮后再在解剖显微镜下仔细查找OCCs。所找到的全部OCCs在成熟培养液中清洗3~5遍后,在成熟培养液中培养36小时后,当观察到第一极体排出时认为卵母细胞发生核的成熟。为保证受精率,所有排出第一极体的成熟卵母细胞均采用卵母细胞浆内单精子注射(ICSI)辅助受精,之后在IVF-20培养液中继续培养2~3天,根据患者的年龄和胚胎发育情况挑选2-3个质量较好的胚胎进行胚胎移植。
患者子宫内膜的准备是根据取卵前后E2水平的高低、子宫内膜的厚度等于取卵当天给予天然雌激素 2~6mg/d,取卵后36 h开始给予黄体支持治疗直至胚胎移植后两周,妊娠者继续给予雌激素及黄体支持至胚胎移植后两个月。
经典成熟培养液的组成为TCM199 +0.075IU/mL FSH+ 10IU/mL hCG+E2;
IVM首先由Cha[9]报道功从手术穿剌卵巢获得不同成熟阶段的未成熟卵母细胞,在体外培养为成熟卵母细胞后进行体外受精和胚胎移植。随后Alan Trounson[10] 报道在阴道B超引导下穿剌未接受促激素剌激的PCOS患者卵巢的2-10mm直径的卵泡,获得不成熟卵进行体外培养并获得妊娠。

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目前IVM在全世界各地开展的还相对不多,报道的临床妊娠率在15%-25%左右。我国最少有两个单位报道了这一技术的应用。早期报道的一组资料进行22个周期的IVM,其卵母细胞体外成熟率、受精率和分裂率分别为65%, 72%和93%,妊娠率27.5%。
早期的报道均不使用小剂量Gn刺激,卵泡期取卵,但取卵数目少。体外培养成熟的难度大,当使用一定量的Gn后,临床取卵率、妊娠率有提高的趋势。取卵前使用绒毛膜促性腺激素(HCG)有利于颗粒细胞的松散,提高取卵率,但也加快了胞核的成熟。
随着人们对卵子成熟机制的深入认识,提出卵子的成熟大致包括三个方面:其一是卵细胞核的成熟:这卵子成熟的关键。胞核的成熟完成了第一次减数分裂并进行第二次减数分裂至中期,第一极体的形成是镜下确定卵子成熟的指标。此外,是胞浆的成熟:包括亚细胞成分(线粒体、囊泡皮质颗粒)的重新组排、特异蛋白质的合成、cAmp的合成、胞浆内微丝微管合成增加、胞浆内成熟促进因子(maturation promoting factor, MPF) 增加等。这对卵母细胞的受精过程及早期胚胎发育有重要的意义。再者是卵细胞膜的成熟,这与精子的粘附及穿透有关。此三方面的协调一致性是卵子质量的根本。大量研究表明,核质成熟的同步化对于卵子质量和胚胎的继续发育具有十分重要的意义。细胞核与卵浆成熟的不同步是体外成熟卵母细胞质量下降的一个重要因素,体外成熟卵母细胞中卵浆成熟落后于核的成熟与(1)取卵前使用HCG有关, 在卵泡发育和卵母细胞成熟的早期阶段促黄体生成素(LH)的需要量是很小的[11]。(2)与体外成熟培养液的组成不理想密切相关。目前所用的成熟培养液与卵母细胞在体内成熟的生理环境不能完全符合。多为单一培养液,没有充分考虑到生理条件下卵母细胞发育的不同阶段所处的环境不同。造成这种卵浆成熟落后于核成熟的现象的原因可能与体外成熟培养液过高的LH有关。虽然学者们一直尝试向成熟培养液中加入各种不同的成分,但由于对卵母细胞及胚胎发育的生物学机制缺乏全面深入的了解, 迄今为止尚没有一种理想的成熟培养液。
细胞核质同步化问题已经引起学者们的广泛重视,最近来自丹麦的一项研究表明,在体外成熟培养液中加入抑制核成熟的细胞周期调节物能够使卵母细胞核质更好的达到同步化,囊胚形成率及孵出率也会明显提高。为我们研究卵母细胞成熟过程中细胞核与细胞浆的同步化提供了一个很好的研究方向,在体外成熟的不同阶段采用不同成分的培养液进行序贯培养可能会更有利于提高卵母细胞及其以后的胚胎发育。
此外,通过对卵母细胞成熟机理的探讨和研究, 可以深入地了解人类卵子和胚胎发育的机制,为将来从冷冻卵巢组织中获取未成熟卵母细胞进行体外成熟奠定实验基础,从而实现了杭州代孕妈妈们生育能力的储备。

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